富含黃酮類、多酚類抗氧化物質的蕓豆酵素

現如今越來越多消費者追求營養的多樣性、易于吸收性和平衡性，酵素發酵飲料作為新型功能性食品逐漸被大眾喜愛。食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、豆谷類、藥食兩用食材等為原料，經多種益生菌發酵制得的富含有機酸、益生菌、礦物質和次生代謝產物等營養成分的功能性微生物發酵產品，具有解酒護肝、美白抗氧化、降糖降脂等功效。

蕓豆（Phaseolus vulgaris Linn）學名菜豆，屬蝶形花科的小宗雜糧作物，是栽培面積僅次于黃豆的豆類農作物。蕓豆富含蛋白質、維生素、皂苷等營養成分，蕓豆膳食纖維、山奈酚、槲皮素可持續性調控機體糖代謝紊亂，改善胰腺組織內質網應激及線粒體功能，維持血糖水平穩態。蕓豆抗性淀粉、α-淀粉酶抑制劑可以降低高脂血癥大鼠血脂代謝水平，改善氧化應激并調控腸道微生物平衡。黃酮類化合物對心血管疾病、癌癥等老年疾病有積極的預防、緩解和治療作用。蕓豆提取物還具有補腎利氣、抗炎抑菌、利水消腫等多種功效，是開發功能性食品的優質原料。

基于蕓豆主要以鮮食為主，存在加工形式及企業較少、綜合利用程度差等問題，同時目前鮮見復合益生菌發酵蕓豆酵素的研究，其代謝產物及抗氧化能力亦沒有報道。監測發酵體系代謝產物及抗氧化活性，是反映蕓豆酵素發酵進程、產品品質和營養價值的重要依據。因此，本文以蕓豆酵素為研究對象，研究不同發酵時間代謝產物變化規律，分析其抗氧化能力，為蕓豆高值利用及精深加工產業鏈提供新思路，同時為綜合開發兼具蕓豆和益生菌營養保健價值的蕓豆酵素產品提供理論依據。

1、pH和總酸含量的變化

pH是衡量發酵過程是否正常的重要條件，酸度是衡量酵素成熟度及發酵液品質的主要指標之一。由圖1可知，發酵液pH隨著發酵時間的延長而不斷降低，總酸含量則逐漸升高。經48h發酵，蕓豆酵素pH由4.01降低至3.44，總酸含量從發酵初期0.03g/100mL至后期增漲至0.57g/100mL。發酵前期總酸含量增幅明顯，分析原因該階段酵母菌大量增殖，在厭氧條件下利用發酵液中的糖原產生CO₂及乙醇，部分CO₂溶于發酵液，同乳酸作用，降低發酵液pH的同時增加總酸含量。接種乳酸菌后其分泌酶水解發酵液中碳源為單糖后進一步利用產生大量乳酸、蘋果酸等有機酸，導致發酵液pH持續降低，總酸含量穩定增長。蕓豆酵素發酵56h時，發酵液營養物質基本被完全消耗，乳酸菌利用有機酸作為代替碳源來維持自身增殖代謝等生物過程，使得總酸含量小幅度升高。發酵體系含多種有機酸，可抑制部分有害菌的生長，同時形成了蕓豆酵素的獨特風味。

2 、還原糖含量與可溶性固形物含量的變化

糖作為碳源是微生物發酵的重要營養物質，其含量的變化是反應酵素液中微生物活動情況的指標之一。由圖2所示，還原糖含量僅在前8h呈現上升趨勢，而后隨著發酵時間的延長而不斷降低。這可能是由于發酵初期優勢菌種酵母菌在蔗糖酶的作用下將蔗糖轉化為果糖和葡萄糖，使發酵液中還原糖含量增加。發酵8~24h時，還原糖含量下降較快，該階段酵母菌已適應此時發酵環境，大量的葡萄糖和果糖被利用生成乙醇用于代謝生長。發酵液中果糖等游離糖利于乳酸菌等厭氧微生物增殖生長，接種乳酸菌其自身分泌β–半乳糖苷酶等水解酶分解乳糖成葡萄糖和半乳糖，并通過糖酵解等代謝途徑將葡萄糖轉化成乳酸，還原糖逐漸減少。發酵48h時，還原糖含量為3.55mg/mL并趨于平緩，證明發酵已基本結束。

可溶性固形物含量可較為直觀反映發酵液品質，若含量過高，發酵體系滲透壓升高易破壞發酵菌種細胞壁及細胞膜特性，導致生長周期停滯或凋亡；含量過低，發酵液口感酸，影響產品風味。由圖2可知，蕓豆酵素可溶性固形物含量隨發酵時間的延長持續下降并趨于穩定，經48h的發酵，發酵液中可溶性固形物含量由17.07%降低至6.13%，發酵體系環境適宜，營養物質充足，微生物在該階段迅速繁殖，大量且持續利用碳水化合物，使得蕓豆酵素可溶性固形物含量逐漸降低。

3、總酚與黃酮含量的變化

蕓豆酵素發酵過程中總酚含量的變化見圖3?？偡雍吭诎l酵階段呈先迅速上升后小幅度下降而后繼續增長的趨勢。楊小幸等研究表明發酵體系中酚類物質含量的變化與發酵原料、發酵工藝條件及微生物種類密切相關。與未發酵清汁相比，發酵24h的蕓豆酵素總酚含量顯著增長約1.4倍，分析原因是原料中酚類物質溶出，其一發酵前期發酵液營養物質充足，微生物大量繁殖代謝產生次生代謝產物，這些有機酸及酶類可溶出蕓豆中的酚類物質；其二高糖濃度形成高滲透壓體系，導致原料大量酚類物質的溶出并呈游離態。發酵32h時，總酚含量略微降低，可能是由于多酚類物質具有抑菌效果，一定濃度的酚類物質會抑制微生物的生長，因此發酵液中優勢菌種會產生降解酚類的物質來維持自身正常繁殖代謝。此外，蛋白質可以與多酚類物質的多元氫鍵和疏水鍵發生反應，也是可能造成多酚含量下降的因素之一。隨著發酵時間的延長，部分微生物逐漸適應發酵環境中的高濃度酚，將一些大分子酚類物質降解為單體酚或小分子量酚類物質，發酵56h時，發酵液總酚含量進一步增長至367.90mg/mL。

由圖3可知，蕓豆酵素發酵過程中總黃酮含量呈現持續升高的趨勢，由初期30.02μg/mL迅速上升至56h的92.31μg/mL，增漲約3倍且具有顯著性差異（P<0.05）。發酵前期優勢菌種酵母菌生長代謝旺盛產生乙醇，溶解了大部分不溶或難溶于水的黃酮類物質，造成發酵液黃酮含量的迅速增加。整個發酵過程中，發酵體系中黃酮類物質始終以不同速率累積，一方面，發酵液的高滲環境及微生物的活動致使植物細胞破裂，原料中抗氧化物質滲出與合成，同時酵母菌及乳酸菌代謝產生酶系將部分碳源轉化為可以發生顯色反應的鄰苯二酚結構[37]。另一方面，發酵后期糖苷與游離態黃酮類物質結合的黃酮醇配糖體被水解，造成發酵液黃酮類物質含量的進一步升高。

4、還原力的變化

由圖4可知，接種酵母菌和乳酸菌后，發酵液還原力均顯著高于未發酵清汁，且還原力隨發酵時間的延長呈現不斷上升的變化趨勢。分析原因，酵母菌和乳酸菌均可通過產生NADH氧化酶、SOD、GSH-Px等過氧化酶類物質清除活性氧。酵母菌單獨發酵時，還原力最高可達0.72μmol/L，可能是由于酵母菌自身含有的細胞壁多糖能夠清除如超氧陰離子自由基等活性氧。發酵56h時，蕓豆酵素還原力為0.88μmol/L，乳酸菌自身具備的抗氧化能力主要是代謝產物及菌體表面的抗氧化物質發揮作用。范昊安研究表明相較于發酵初期，蘋果梨酵素的還原力顯著升高。適當的延長發酵時間有利于蕓豆酵素還原力的增強。

5、ABTS自由基清除率的變化

ABTS是一種穩定存在的自由基，可與抗氧化成分發生反應而使體系褪色，清除自由基能力由樣品對其吸光度的影響所反映。蕓豆酵素發酵過程中ABTS自由基清除率的變化如圖5所示，發酵過程中ABTS自由基清除率呈現先快速上升后趨于平緩的趨勢。發酵前32h，ABTS自由基清除率從30.01%迅速上升至82.49%，隨后以小幅度趨勢上升至發酵后期趨于平緩，整個發酵過程蕓豆酵素ABTS自由基清除率增漲約3倍。研究表明，ABTS自由基清除能力與高濃度酚類、有機酸等物質的芳香環數量、分子數量和羥基取代基的性質密切相關。Anna等人發現酚類化合物與ABTS自由基清除率存在密切關系，分析其可能是造成蕓豆酵素具有高ABTS自由基清楚能力的主要因素。

6、相關性分析

蕓豆酵素復合發酵過程中還原糖、總酚、黃酮等功能成分與還原力、ABTS自由基清除力相關性分析結果如圖6及表1所示。還原力與ABTS自由基清除力呈現極顯著正相關性（P<0.01），與周偏對諾麗酵素的研究結果一致。蕓豆酵素黃酮與還原力呈極顯著正相關（r=0.99，P<0.01），與ABTS自由基清除力呈極顯著正相關（r=0.98，P<0.01）；總酚與還原力、ABTS自由基清除力均呈極顯著正相關（r=0.96，P<0.01），表明黃酮類物質和多酚類物質是蕓豆酵素發酵過程中重要的抗氧化物質。

探究蕓豆酵素發酵過程中代謝產物含量以及抗氧化活性的動態變化規律，結果表明，pH呈現持續下降的趨勢，總酸變化趨勢與之相反。發酵初期還原糖含量小幅度上升后不斷降低至3.56mg/mL。發酵56h時可溶性固形物含量達到最低6.01%?？偡雍靠傮w呈現上升趨勢，僅在發酵32h時略微降低。與未發酵蕓豆清汁相比，發酵48h的蕓豆酵素黃酮含量顯著提高3倍。還原力和ABTS自由基清除率呈現迅速升高后趨于平緩的趨勢，發酵大幅度提升蕓豆酵素的抗氧化能力，抗氧化活性的提高與總酚和黃酮含量的變化顯著正相關（P<0.05）。代謝產物含量的變化規律可以較為直觀反映發酵體系周期進程以及發酵液生物活性物質積累情況。蕓豆酵素代謝產物和抗氧化性的研究可為酵素產品的開發及推廣利用提供一定的理論依據及數據支持。